WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Базальный уровень ионов кальция и его регуляция в волокнах постуральной мышцы крысы и монгольской песчанки в условиях гравитационной разгрузки

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЛТАЕВА

Эржена Григорьевна

базальный уровень ионов кальция и его регуляция в волокнах постуральной мышцы крысы и монгольской песчанки в условиях гравитационной разгрузки

03.03.01 – физиология

03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Шенкман Борис Стивович

кандидат физико-математических наук

Огнева Ирина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович

доктор биологических наук, профессор Рубцов Александр Михайлович

Ведущая организация:

Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита диссертации состоится « 24 » февраля ­­ 2011 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук.

Автореферат разослан « 20 » января 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из основных медицинских проблем, препятствующих длительным космическим полетам, является снижение работоспособности, в том числе в силу атрофических изменений скелетных мышц. Скелетная мышца – один из наиболее пластичных органов, способный адаптироваться к изменению условий функционирования, воздействующих как на мышцу, так и на организм в целом. Длительное снижение функциональной активности постуральных мышц, особенно, камбаловидной мышцы, в условиях снижения гравитационного стимула (пребывание в условиях невесомости, устранение опоры на все или только задние конечности, переход в горизонтальное положение), так называемой гравитационной разгрузки, приводит к глубокой структурной и функциональной перестройке мышечной ткани. Снижение функциональных характеристик скелетных мышц – одно из важнейших проявлений гипогравитационного синдрома (Oganov et al., 1976; Козловская и др., 1984; Edgerton et al., 1998; Adams et al., 2003; Shenkman, Nemirovskaya, 2008). В литературе имеются данные о снижении сократительных характеристик мышечных волокон млекопитающих (силы и работоспособности), жесткости мышцы и ее волокон (Mounier et al., 1989; 2000; Stevens et al., 1993; Widrick et al., 1999; Ogneva et al., 2009, 2010). Изменение сократительных свойств мышц связывают с уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон (атрофия) (Оганов и др., 1982; Riley et al., 2002) и соответствующим изменением объема миофибриллярного аппарата (Stevens et al., 1993; Kozlovskaya et al., 1996; Desplanches et al., 1997; Mounier et al., 2000; Fitts et al., 2000). Также невесомость приводит к разрастанию соединительнотканных структур (Karpakka et al., 1991; Miller et al., 2001), трансформации миозинового фенотипа волокон в сторону увеличения экспрессии быстрых изоформ тяжелых цепей миозина (Caiozzo et al., 1994; 1998; 2000; Edgerton et al., 1995; 1998), деградации ряда цитоскелетных белков (Chopard et al., 2001; Гасникова и др., 2006). В основе мышечных перестроек лежит направленное изменение экспрессии большого числа генов, формирование нового целостного, так называемого, «атрофического» паттерна экспрессии (Kandarian, Stevenson, 2002).

Эти данные позволяют предположить, что реализация «атрофической» программы осуществляется, прежде всего, на клеточном уровне – на уровне мышечных волокон. Причем, ее запуск осуществляется путем последовательной активации протеолитических систем, и в первую очередь системы кальций-зависимых протеаз – кальпаинов (Kandarian, Stevenson, 2002; Shenkman, Nemirovskaya, 2008). Активность кальпаинов отмечается уже после первых суток функциональной разгрузки (Enns, Belcastro, 2007), по всей видимости, эти изменения в условиях снижения гравитационного стимула связаны с увеличением базального уровня ионов кальция внутри мышечных волокон (Ingalls et al., 1999, 2001).

Ионы кальция имеют большое значение для скелетных мышц, так как выполняют регуляторную и сигнальную функции в клетке. Они играют важную роль в электромеханическом сопряжении, обеспечивая передачу сигнала о мышечном сокращении на миофибриллы. Однако до сих пор динамика накопления кальция в условиях разгрузки остается практически неизученной.

Помимо этого, остаются неясными механизмы поступления избыточного кальция в миоплазму мышечных волокон и его удаления в условиях разгрузки. Существуют предположения, что ионы кальция могут поступать внутрь клетки через сарколемму из межклеточного пространства посредством медленных кальциевых каналов L-типа, которые специфически блокируются нифедипином. Кроме того, показано, что их экспрессия в условиях разгрузки увеличивается (Kandarian et al., 1992). С другой стороны, большое значение имеет и механизм элиминации ионов кальция из миоплазмы мышечных волокон. Ответственной за этот процесс является кальциевая АТФаза саркоэндоплазматического ретикулума – SERCA, функционирование которой в условиях гипогравитации также мало изученно. Однако слаженная работа кальциевых каналов и Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает поддержание кальциевого гомеостаза в клетке, который очень важен, так как в настоящее время увеличение внутриклеточного содержания кальция рассматривается как один из основных пусковых факторов в реакции мышечных волокон на изменение гравитационного стимула (Kandarian, Stevenson, 2002). Таким образом, исследование физиологической роли базального содержания ионов кальция в миоплазме мышечных волокон и биофизических механизмов его поступления и элиминации представляет собой актуальную задачу современной гравитационной биологии.



Цель работы

Изучить динамику накопления ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы грызунов и роль базального уровня ионов кальция в активации протеолитических процессов при моделируемой гравитационной разгрузке.

Задачи исследования:

  1. Проследить динамику изменения уровня кальция в камбаловидной мышце на разных сроках вывешивания.
  2. Проверить гипотезу о ключевой роли медленных кальциевых каналов L-типа в накоплении ионов кальция в миоплазме мышечных волокон.
  3. Исследовать изоформный состав кальциевой АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума – SERCA в волокнах камбаловидной мышцы в условиях функциональной разгрузки.
  4. Изучить влияние накопления базального кальция в миоплазме волокон на активацию кальпаиновой протеолитической системы на начальных этапах функциональной разгрузки.
  5. Сравнить динамику накопления и элиминации ионов кальция в миоплазме постуральных мышц при гравитационной разгрузке у крысы породы Wistar и монгольской песчанки.

Научная новизна работы:

– увеличение базального содержания ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы крысы и монгольской песчанки происходит уже после первых суток гравитационной разгрузки;

– применение нифедипина, селективного блокатора медленных кальциевых каналов L-типа, приводит к снижению интенсивности накопления внутриклеточного содержания ионов кальция в волокнах камбаловидной мышцы крысы в условиях разгрузки;

– моделируемая разгрузка приводит к увеличению доли мышечных волокон, экспрессирующих быструю изоформу кальциевой АТФазы саркоплазматического ретикулума, на ранних сроках: у крысы после 3-х суток, у монгольской песчанки уже после первых.

– в условиях кратковременной функциональной разгрузки увеличение базального внутриклеточного содержания ионов кальция непосредственно влияет на содержание как мембранной, так и цитоплазматической фракций кальпаинов в миоплазме волокон камбаловидной мышцы крысы;

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование расширяет представления о физиологической роли ионов кальция, о механизмах, влияющих на изменение кальциевого гомеостаза в камбаловидной мышце млекопитающих, а именно крысы и монгольской песчанки, в условиях гравитационной разгрузки. Подобное исследование в условиях снижения гравитационного стимула имеет большое значение в решении вопроса поддержания функциональной активности скелетных мышц в условиях длительных космических полетов. Применение в данной работе селективного блокатора дигидропиридиновых кальциевых каналов позволило достоверно снизить базальное содержание ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы на ранних сроках моделируемой разгрузки. Возможно, развитие этого подхода в дальнейшем позволит найти способ для, по крайней мере, частичного предотвращения негативных последствий невесомости на функциональное состояние постуральных мышц.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Увеличение базального содержания ионов кальция в миоплазме мышечных волокон камбаловидной мышцы – один из наиболее ранних эффектов гравитационной разгрузки. Показано участие медленных кальциевые каналов L-типа в этом процессе.
  2. Изменение паттерна экспрессии изоформ Са2+-АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума вносит вклад в механизм элиминации ионов кальция из мышечного волокна в условиях разгрузки.
  3. Показано влияние увеличения базального уровня ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы на активацию цистеиновых кальций-зависимых протеаз – кальпаинов in vivo на ранних сроках гравитационной разгрузки.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждались на 12-м Европейском симпозиуме студентов биологов (Коимбра – Авейро, Португалия, 2008); 9-ой Конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010); 31-м Международном симпозиуме по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 2010).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 02.11.2010 г).

По теме диссертации опубликовано 26 печатные работы. В том числе 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.





Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований ГНЦ РФ – ИМБП РАН, программ Отделения биологических наук РАН, грантов РФФИ 10-04-00106-а, 04-04-49044-а, 07-04-00763-а.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 139 страницах, иллюстрирован 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 336 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила камбаловидная мышца крысы породы Wistar (100 половозрелых самцов) и монгольской песчанки (Meriones unguiculatus) (73 половозрелых самца). Все эксперименты на животных были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН.

Методы исследования

1. Определение изменения содержания ионов кальция в одиночных мышечных волокнах проводили в день взятия биоматериала. Выделенную камбаловидную мышцу помещали в раствор Рингера на 40 минут, затем препараты фиксировали, инкубируя целую мышцу в растворе R (Stevеns et al., 1993) смешанном в соотношении 1:1 с 4%-ным раствором формалина. После отмывки от формалина выделяли единичные мышечные волокна, которые окрашивали флуоресцентным кальциевым зондом Fluo-4AM (Molecular Probes, США). Уровень содержания кальция оценивали по интенсивности флуоресценции, которую фиксировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica (Германия).

2. Определение доли мышечных волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA). Поперечные криостатные срезы толщиной 10 мкм окрашивали моноклональными антителами против быстрой и медленной изоформ SERCA I и II (Sigma и Novocastra Laboratories, США) по стандартной методике. Для проявления использовали вторичные поликлональные антитела конъюгированные с флуоресцина изотиоцинатом (FITC) (Sigma, США). Подсчитывали количество волокон, окрашенных SERCA I или SERCA II, к общему количеству волокон на срезе, таким образом подсчитывали процентную долю волокон, экспрессирующих быструю или медленную изоформу Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума.

3. Определение доли волокон, экспрессирующих медленную и быструю изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ). Поперечные криостатные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм окрашивали первичными моноклональными антителами против медленной и быстрой изоформ тяжелых цепей миозина (Novocastra Laboratories, США) по стандартной методике. Для проявления использовали вторичные поликлональные антитела конъюгированные с FITC (Sigma, США). Подсчитывали отношение окрашенных волокон к общему количеству волокон на срезе, тем самым, определяя процентную долю волокон, экспрессирующих медленную или быструю изоформу ТЦМ.

4. Оценку площади поперечного сечения (ППС) мышечных волокон проводили на поперечных криостаных срезах, окрашенных антителами против медленных и быстрых миозинов. Чтобы определить ППС медленных мышечных волокон измеряли площадь неокрашенных волокон на срезах, окрашенных антителами против быстрой изоформы ТЦМ, и, наоборот, для определения ППС быстрых мышечных волокон. В среднем анализировали 100 волокон с каждого среза.

5. Определение активности кальпаинов в камбаловидной мышце проводили в соответствии с методом Enns, Belcastro (2006). Образцы скелетных мышц гомогенизировали, выделяли цитоплазматическую и мембраносвязанную фракции белка. Активность кальпаинов определяли спектрофотометрически на приборе СФ 2000 (ЗАО «ОКБ-Спектр», Россия), используя в качестве субстрата щелочно-денатурированный казеин. Из каждой пробы отбирали аликвоты, в которых определяли остаточное содержание белка по методу Брэдфорд (1976). Активность кальпаинов измеряли при длине волны 595 нм. Для растворимой и мембраносвязанной фракций активность кальпаинов выражали как относительный прирост по сравнению с контрольным значением для каждой фракции.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета математического анализа MS Excel. Оценку значимости различия средних значений показателя в независимых выборках проводили по t-критерию Стьюдента. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали достоверным при уровне значимости p0.05. Результаты представлены в виде М±m, где М – среднее значение, m – ошибка среднего значения.

Организация экспериментов

1. Антиортостатическое вывешивание животных проводили согласно стандартной модели Ильина-Новикова (1981) в модификации Morey-Holton (2002).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.