WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Симбиотическая ассоциация wolbachia–drosophila melanogaster: ультраструктурная организация и взаимодействие в условиях стресса

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЖУКОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СИМБИОТИЧЕСКАЯ АССОЦИАЦИЯ WOLBACHIADROSOPHILA MELANOGASTER: УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Учреждения Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Киселева Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Высоцкая Л.В. Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск доктор биологических наук, профессор Бугров А.Г. Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск
Ведущее учреждение: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «__» ___________ 2011 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр-т Ак. Лаврентьева, д. 10, тел/факс (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «__» __________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Хлебодарова Т.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия существенное внимание уделяется исследованию механизмов симбиоза, в частности анализу взаимодействия эндосимбионтов и их хозяев, так как на основе полученных знаний становится возможным использовать влияние эндосимбионтов на различные функции хозяина. Эффективность симбиоза зависит от генотипа организмов и условий их обитания (Thomas, Blanford, 2003). В естественной среде обитания все организмы подвержены влиянию различных неблагоприятных факторов, и изучение особенностей поведения симбионтов в условиях стресса обеспечивает получение новой информации о процессах, происходящих в симбиотических ассоциациях в природе. Хозяин и симбионт, каждый в отдельности, могут специфически реагировать на изменения условий окружающей среды, а ответ симбиотической ассоциации в целом будет зависеть от взаимодействия партнеров в новых условиях. Можно предположить, что под влиянием экспериментально созданных неблагоприятных факторов среды будет происходить либо активация, либо ингибирование процессов взаимодействия симбионтов, и исследование их организации и динамики в таких условиях позволит выявить дополнительные особенности отношений в системе эндосимбионт-хозяин. До настоящего времени влияние изменений факторов среды на морфологию и взаимоотношения симбионтов, особенно на ультраструктурном уровне, мало изучены и являются активно развивающейся и актуальной областью исследований.

Эндосимбиотические бактерии рода Wolbachia широко распространены среди членистоногих и вызывают у них изменения репродуктивных функций, такие как цитоплазматическая несовместимость, партеногенез, феминизация и андроцид (Werren et al., 2008). Исследование особенностей строения и функциональной роли Wolbachia позволяет выявить механизмы симбиоза на клеточном и организменном уровнях, и найти возможные пути влияния бактерий на численность популяций насекомых-вредителей сельского хозяйства, а также на виды организмов, патогенных для животных и человека.

Одним из удобных модельных объектов для исследования процессов взаимодействия Wolbachia-хозяин является Drosophila melanogaster, цитологические и генетические особенности которой достаточно подробно изучены. В настоящей работе мы использовали этот объект, а в качестве стрессовых факторов среды для симбиотических организмов было выбрано влияние на них повышенной температуры и голодания хозяина.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - провести исследование влияния повышенной температуры и голодания на морфологию клеток яичников и ранних эмбрионов D. melanogaster, симбиотических бактерий Wolbachia в этих клетках, а также на взаимодействие бактерий и хозяина на клеточном и субклеточном уровнях.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать и сравнить ультраструктуру клеток яичников и синцитиальных эмбрионов D. melanogaster, неинфицированных и инфицированных бактериями Wolbachia, в стандартных лабораторных условиях и после воздействия повышенной температуры и голодания.



2. Провести сравнительный анализ распределения и морфологии бактерий в клетках яичников и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster в стандартных лабораторных условиях и после стрессовых воздействий.

3. Провести сравнительный анализ структурно-функциональных взаимодействий между бактериями и внутриклеточными органеллами хозяина в стандартных лабораторных условиях и после воздействия на D. melanogaster повышенной температуры и голодания.

Научная новизна

С использованием методов световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также методов молекулярной биологии, в работе впервые проведен подробный комплексный анализ тонкой структурной организации и взаимодействия симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) – D. melanogaster (линия w1118) в экспериментальных стрессовых условиях. Установлено, что тепловое воздействие и голодание хозяина вызывают различные изменения морфологии Wolbachia штамм wMelPop в цитоплазме синцитиальных эмбрионов и клеток яичников, однако не влияют на их распределение у мух линии w1118.

Впервые в клетках яичников D. melanogaster w1118 описаны Wolbachia, контактирующие с электронно-плотными тельцами, которые предположительно являются покоящейся формой бактерий. Их количество увеличивается при голодании мух.

На ультраструктурном уровне продемонстрировано, что, несмотря на изменение морфологии каждого из симбионтов в ответ на стресс, тесные структурно-функциональные контакты бактерий с цитоплазматическими органеллами хозяина сохраняются.

Впервые показано, что присутствие Wolbachia штамм wMelPop увеличивает частоту апоптоза в гермариях яичника D. melanogaster w1118 по сравнению с неинфицированными мухами.

Практическая значимость работы

Штамм wMelPop в настоящее время считается наиболее патогенным штаммом бактерий Wolbachia, снижающим продолжительность жизни у D. melanogaster и комаров. Результаты нашего исследования, демонстрирующие особенности поведения партнеров симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) – D. melanogaster (линия w1118) в стрессовых условиях, могут быть использованы при построении моделей для поиска путей воздействия с помощью Wolbachia на численность популяций насекомых, являющихся переносчиками заболеваний человека и животных, а также вредителей сельского хозяйства.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop вызывают увеличение апоптоза клеток в контрольной точке гермария яичника D. melanogaster.
  2. Присутствие Wolbachia в организме D. melanogaster не влияет на изменение морфологии клеток яичников, происходящие под действием повышенной температуры и голодания.
  3. При действии повышенной температуры и голодания характер распределения Wolbachia штамм wMelPop в синцитиальных эмбрионах и клетках яичников D. melanogaster сохраняется, однако происходят различные изменения морфологии бактерий, обусловленные как их дегенерацией, так и адаптацией к стрессу.

4. В условиях теплового стресса и голодания мух бактерии Wolbachia продолжают тесно контактировать с эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями в клетках яичников D. melanogaster.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине» (Новосибирск, 2007); V Международной конференции, посвященной биологии Wolbachia (Колимбари, Крит, Греция, 2008); IV съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, Узбекистан, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010); Научной школе-конференции «Успехи в исследовании симбиоза» (Реховот, Израиль, 2010); Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых отечественных журналах.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по тепловому воздействию на симбионтов проведены совместно с Д.А. Ворониным.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (157 ссылок). Работа изложена на 161 страницах, содержит 58 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали линию Drosophila melanogaster w1118, полученную от проф. С. О’Нейлла (Университет Квинсланда, Австралия), инфицированную бактериями Wolbachia, штамм wMelPop. Мух содержали при температуре 25C на стандартном дрожжевом или на обогащенном корме. При содержании мух на обогащенном корме стандартный корм покрывали слоем дрожжевой пасты и ежедневно меняли на свежий. Для получения неинфицированной линии w1118Т мух содержали в течение двух поколений на корме с добавлением тетрациклина (0,03 %), а три последующих поколения – на стандартном корме. Зараженность D. melanogaster бактериями проверяли с помощью ПЦР, с использованием ДНК, выделенной из яичников мух, и праймеров к фрагменту гена поверхностного белка Wolbachia wsp 81F/wsp 691R (Braig et al., 1998).





Для теплового воздействия мух помещали в водный термостат в предварительно нагретые до 36С пробирки с кормом на 75 мин. Яичники и эмбрионы D. melanogaster фиксировали через 3,5-4 ч после воздействия.

Голодание мух проводили в термостате при температуре 25°С. 5-дневных мух переносили со стандартного корма в пустые пробирки, которые закрывали влажной ватой. Яичники фиксировали сразу после 24 ч голодания.

Для определения продолжительности жизни D. melanogaster в условиях голодания, 5-дневных мух наркотизировали и разделяли на самцов и самок. 30 особей помещали в пустые пробирки, закрытые влажной ватой, и ставили в термостат с температурой 25°С. Учет погибших мух вели через 24, 40, 48, 58 и 72 ч. Эксперимент проводили в четырех повторностях, в каждом из экспериментов учитывали продолжительность жизни 120-150 особей каждой группы мух. Обработку результатов проводили с помощью стандартных статистических методов (Васильева, 2000).

При определении выживаемости потомства линий D. melanogaster 100-200 мух в возрасте 2-6 дней помещали в стеклянную бутылку со съемным дном, содержащим корм, в термостат с температурой 22-24°С на 1 ч. Затем мух из бутылки удаляли, подсчитывали отложенные на корм яйца и помещали в термостат при 22-24°С на время, пока из них не разовьются все имаго. Определение выживаемости мух производили путём подсчёта отношения числа развившихся мух к числу отложенных яиц, принимаемому за 100%.

Оценку уровня апоптоза в яичниках D. melanogaster проводили с помощью окраски клеток яичников акридиновым оранжевым (Abrams et al., 1993; Foley, Cooley, 1998). Яичники 5-дневных мух выделяли в растворе Эфрусси-Бидла Рингера, окрашивали 3 мин. в растворе акридинового оранжевого (5 мкг/мл) на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) при комнатной температуре. Затем яичники переносили на предметное стекло в каплю галокарбонового масла, покрывали покровным стеклом и анализировали в флуоресцентном микроскопе (Axioscop 2 plus, Zeiss, Германия). Процент гермариев с апоптозом подсчитывали как отношение количества гермариев с апоптозом к общему числу проанализированных гермариев.

Фиксацию яичников и синцитиальных эмбрионов D. melanogaster для электронно-микроскопического анализа проводили согласно ранее описанному методу (Terasaki et al., 2001; Дудкина и др., 2004). Затем образцы обезвоживали в спирте, ацетоне и заключали в смолу Agar 100 Resin. Ультратонкие срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали в электронном микроскопе JEM 100 SX (JEOL, Япония).


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфология клеток яичника неинфицированной и инфицированной Wolbachia D. melanogaster, линии w1118Т и w1118, на разных стадиях оогенеза

В яйцевых трубках видов рода Drosophila выделяют два отдела: гермарий и вителлярий (King et al., 1956; Dansereau et al., 2005). Наши данные показали, что в яйцевых трубках яичников мух линий w1118 и w1118Т клетки гермария сходны по морфологии и имеют округлую или уплощенную форму, небольшие размеры (около 5 мкм), достаточно крупные ядра и небольшое количество цитоплазмы. Основываясь на морфологических особенностях строения, в оогенезе D. melanogaster выделяют 14 стадий развития яйцевых камер (King et al., 1956). С использованием световой и электронной микроскопии нами была проанализирована морфология клеток вителлярия, включающих ооциты, питающие и фолликулярные клетки, на стадиях оогенеза 1-10. Следует отметить, что на стадиях оогенеза 11-14, когда ооцит занимает практически весь объем яйцевой камеры, его исследование в электронном микроскопе было затруднено из-за вителлиновой оболочки, синтезируемой фолликулярными клетками вокруг ооцита и препятствующей его нормальной фиксации. Сравнительное исследование срезов яичников в световом и электронном микроскопе не выявило каких-либо различий в организации яйцевых камер вителлярия неинфицированных и инфицированных Wolbachia мух. Таким образом, присутствие бактерий не изменяет организацию яйцевых камер яичника D. melanogaster и тонкую морфологию клеток гермария и вителлярия.

Ультраструктура бактерий Wolbachia штамм wMelPop и их распределение в клетках яичника и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118

Электронно-микроскопическое исследование показало, что в цитоплазме всех типов клеток яичника и в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 бактерии Wolbachia имеют кокковидную или палочковидную форму, варьируют в размере от 0,5 до 1,4 мкм и окружены трехслойной оболочкой (Рис. 1 а). В бактериальном матриксе выявляется большое количество рибосом, а также расправленные нити ДНК и компактный хроматин. Во всех типах клеток вителлярия яичников впервые обнаружены Wolbachia, тесно контактирующие с округлыми электронно-плотными тельцами, расположенными под наружной оболочкой бактерий (Рис. 1 б, в). Такие тельца диаметром 0,2-0,5 мкм имеют

 Бактерии Wolbachia в цитоплазме клеток яичников. а –-1

Рис. 1. Бактерии Wolbachia в цитоплазме клеток яичников.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.