WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Сравнительная характеристика эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки in vitro

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

УДАРЦЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОВ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ IN VITRO

03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология

03.03.01 - физиология 

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна

кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Болтовская Марина Николаевна

доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация: Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится «___» марта 2011 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН (НИИМЧ РАМН) по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИМЧ РАМН

Автореферат разослан « » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Фотодинамическое воздействие (ФДВ) – неинвазивный двухкомпонентный метод, одним элементом которого является фотосенсибилизатор – вещество, повышающее чувствительность биологических тканей к свету, а другим – низкоинтенсивное лазерное излучение. В результате взаимодействия фотосенсибилизатора и света определенной длины волны происходит образование активных форм кислорода (АФК), которые, как известно, являются цитотоксичными агентами, вызывающими структурные повреждения клеток и приводящими к их гибели [Гельфонд, 2007; Castano, Demidova and Hamblin, 2004].

Метод ФДВ был впервые описан в 60-х годах ХХ века и с тех пор активно применяется в клинической практике для лечения онкологических и некоторых воспалительных (ревматоидный артрит, акне, псориаз и др.) заболеваний [Миронов, 1996; Странадко, 2002; Чиссов, Соколов, Булгакова и Филоненко, 2003; Толстых, Дербенев, Кулешов и др., 2008; Жилова, Бутарева и Волнухин, 2010]. При этом эффективная элиминация опухолевых клеток основана на селективном накоплении в них фотосенсибилизатора за счет более высокой метаболической активности по сравнению с окружающими здоровыми клетками. Наличие погибших клеток и их фрагментов индуцирует процесс естественной тканевой репарации, заключающийся в элиминации разрушенного клеточного материала и представляющий собой последовательные фазы воспалительной реакции. Возможность запуска аналогичных изменений в очагах поражений сосудистой стенки создает предпосылки для использования этого подхода для предотвращения дальнейшего развития патологического процесса.

В последние годы был проведен ряд успешных доклинических исследований по лечению пациентов со стенозами периферических артерий с помощью ФДВ [Jenkins, Buonaccorsi, Raphael et al., 1999; Mwipatayi, Hockings, Hofman et al., 2008]. При попытках применения этого подхода для регрессии атеросклеротических поражений следует учитывать, что, в отличие от рестенозов, подобные патологические изменения артерий человека – результат сложного взаимодействия различных типов клеток: моноцитов-макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток, эндотелия, гладкомышечных и субэндотелиальных стромальных клеток. Кроме того, в атеросклеротических поражениях нельзя однозначно указать клетки-мишени для ФДВ, так как одни и те же клетки, в зависимости от фазы атеросклеротического поражения, могут выполнять разнонаправленные функции (макрофаги – фагоцитоз липидов vs. синтез ферментов, разрушающих соединительную ткань). С другой стороны, в отличие от опухолей, в случае атеросклеротических поражений или рестенозов, не ставится задача полной ликвидации какого-либо типа клеток. Достаточно приостановить интенсивность процесса, например, за счет снижения фагоцитарной активности макрофагов или пролиферативной активности субэндотелиальных стромальных клеток интимы.

Одной из проблем применения ФДВ является отсутствие «идеального» фотосенсибилизатора – все фотоактивные вещества, разрешенные в настоящее время к клиническому применению (порфирины, фталоцианины, хлорины и др.), обладают рядом недостатков (неоднородный химический состав, малая селективность накопления в клетках-мишенях, длительная повышенная кожная фоточувствительность и др.). В связи с этим остро встает вопрос о разработке новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами, отвечающих современным требованиям: наличие интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области спектра (650 нм 800 нм), высокий квантовый выход триплетного состояния, постоянный химический состав, высокая селективность накопления в тканях-мишенях, быстрое выведение из организма, низкая токсичность, устойчивость при хранении и введении в организм. К таким перспективным красителям относят Фталосенс® (новый фотосенсибилизатор ряда фталоцианинов) и про-фотосенсибилизатор 5-аминолевулиновую кислоту.



Таким образом, гетерогенность клеточной популяции сосудистой стенки, а также отсутствие «идеальных» фотоактивных веществ диктуют необходимость проведения специальных исследований, посвященных изучению участия различных клеток в процессах, которые могут происходить после ФДВ в артериальной стенке, адаптации имеющихся и поиску новых фотосенсибилизаторов, а также оптимизации условий ФДВ для применения при патологии сосудов.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки в модели in vitro.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) разработать тест-систему для изучения эффектов фотодинамического воздействия на клетки сосудистой стенки in vitro;

2) изучить динамику накопления и выведения фотосенсибилизатора Фотосенс® в макрофагах, эндотелиальных и субэндотелиальных стромальных клетках человека;

3) изучить влияние фотодинамического воздействия с использованием Фотосенса® и его компонентов на клетки сосудистой стенки человека;

4) исследовать влияние дозы фотодинамического воздействия на механизм клеточной гибели;

5) проанализировать влияние фотодинамического воздействия на функциональные свойства клеток сосудистой стенки;

6) сравнить эффекты фотодинамического воздействия с использованием экзогенных фотосенсибилизаторов и про-фотосенсибилизатора на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки человека.

Научная новизна

Впервые проанализировано влияние фотодинамического воздействия (ФДВ) с использованием двух фотосенсибилизаторов (Фотосенс® и Фталосенс®) и одного про-фотосенсибилизатора (5-аминолевулиновая кислота) на эндотелиальные клетки, макрофаги и субэндотелиальные стромальные клетки, которые играют важнейшую роль в формировании поражений сосудистой стенки.

Получены новые данные, свидетельствующие о различной чувствительности клеток сосудистой стенки к ФДВ. Впервые показано, что цитотоксический эффект ФДВ определяется не только способностью клеток сосудистой стенки накапливать Фотосенс®, но и их функциональными особенностями, в частности, возможностью индукции в них активных форм кислорода. Установлено, что активация эндотелия увеличивает его устойчивость к ФДВ.

Впервые изучены эффекты низкоинтенсивного ФДВ на функциональные особенности клеток сосудистой стенки. Показано, что при использовании низких доз ФДВ (0,25 Дж/см2) происходит уменьшение экспрессии основных молекул межклеточной адгезии эндотелиальных клеток (VCAM-1 и E-селектина), а также значительно снижается адгезия мононуклеаров к TNF-активированному эндотелию. Впервые установлено, что ФДВ низкой интенсивности сопровождается снижением фагоцитарной активности макрофагов, уменьшением активности секретируемых ими матриксных металлопротеаз-2 и -9 и снижением уровня секреции интерлейкина-8, что свидетельствует об антивоспалительном воздействии низких доз ФДВ.

Впервые показано, что ФДВ с использованием 5-аминолевулиновой кислоты может обеспечить селективную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток интимы. Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что среди выбранных фотосенсибилизаторов ФталосенсС® позволяет наиболее эффективно регулировать численность клеток сосудистой стенки.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанная модель для изучения эффектов ФДВ in vitro позволяет подбирать и оптимизировать условия воздействия на различные клетки для выполнения экспериментальных и клинических задач. Выявлены механизмы реализации ФДВ различной интенсивности в эндотелиальных клетках, макрофагах и субэндотелиальных стромальных клетках. Данные, полученные в работе, существенно дополняют представления о влиянии ФДВ на клетки сосудистой стенки, а также позволяют расширить область применения этого метода.

Результаты исследования могут стать основой для предклинических испытаний, направленных на апробацию ФДВ в качестве одного из новых методов функциональной диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

  1. Фотодинамическое воздействие с использованием Фотосенса® позволяет эффективно элиминировать клетки сосудистой стенки, чувствительность которых к этому воздействию in vitro увеличивается в ряду макрофаги – субэндотелиальные стромальные клетки – эндотелиальные клетки и определяется их функциональными свойствами.
  2. В условиях in vitro низкоинтенсивное фотодинамическое воздействие с использованием Фотосенса® оказывает противовоспалительный эффект на клетки сосудистой стенки, значительно модифицируя их функциональные свойства, что выражается в уменьшении их способности к адгезии, снижении фагоцитарной и секретирующей (матриксные металлопротеиназы-2, -9) активности.
  3. Использование различных фотосенсибилизаторов позволяет оптимизировать условия воздействия в зависимости от поставленных задач: фотодинамическое воздействие с использованием 5-аминолевулиновой кислоты обеспечивает избирательную элиминацию субэндотелиальных стромальных клеток, в то время как Фталосенс®-ФДВ вызывает тотальную гибель всех клеток сосудистой стенки.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были доложены и обсуждены на: 7-й – 9-й Конференциях молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённых дню Космонавтики (Москва, 2008, 2010); 7-й Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, Москва, 2009); 5-й Конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); 8-й Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); 28th, 29th ASLMS Annual Conference (USA, Kussimmee, 2008; Washington DC, 2009); 15th International Symposium on Atherosclerosis (Boston, 2009); 23th International Congress Laser Medicine Laser Florence 2009 (Florence, Italy, 2009); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 9th WALT Congress (Bergen, Norway, 2010); межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН 17.01.2011 г.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 30.11.2010 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при частичной поддержке гранта МНТЦ № 2579, гранта РФФИ № 07-04-01504а и Госконтракта Минобрнауки № 02.518.11.7141.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 160 страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит из 289 цитируемых источников, из которых 42 - на русском и 247 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В качестве моделей основных типов клеток, принимающих участие в развитии поражений сосудистой стенки, использовали нормальный и TNF-активированный эндотелий пупочной вены человека (ЭК пупочной вены) 1-4 пассажей, эндотелий аорты человека (ЭК аорты) 1-4 пассажей, первичную культуру клеток субэндотелиального слоя аорты человека, мезенхимные стромальные клетки жировой ткани человека (лМСК) 1-10 пассажей и первичную культуру макрофагов (Мф) человека.

Для определения кинетики накопления Фотосенса® (ФС®) клетки инкубировали с фотосенсибилизатором в конечной концентрации 10 мкг/мл от 1 до 72 ч и лизировали 0,1 М NaOH. В полученном лизате определяли интенсивность флуоресценции ФС® ( возбуждения = 608 нм, испускания = 687 нм) и концентрацию белка. Концентрацию ФС® в лизате определяли по калибровочному графику, полученному при измерении интенсивности флуоресценции в пробах с известными концентрациями ФС®. Внутриклеточное содержание ФС® определяли как количество ФС® на 1 мг клеточного белка [нг/мг белка]. Для определения кинетики выведения клетки инкубировали с ФС® в течение 24 ч, затем производили смену среды, инкубировали в ростовой среде без ФС® от 1 до 48 ч и определяли содержание ФС® в клетках.

Для проведения ФДВ в среду культивирования добавляли ФС® (10 мкг/мл), Фталосенс® (ФтС®) (2 мкг/мл) и 5-аминолевулиновую кислоту (АЛА) (2 мМ) (Рис. 1). Через 24 ч краситель отмывали, клетки облучали различными дозами от 0,25 до 50 Дж/см2. Облучение производили лазерным аппаратом для ФДВ «Азор – ФДТ», длина волны облучения составляла 675 нм для ФС®, 692 нм для ФтС® и 633 нм для АЛА. Эффект ФДВ анализировали через различные сроки (1–24 ч) после облучения.

 Химические формулы используемых в работе фотосенсибилизаторов-1
Рисунок 1. Химические формулы используемых в работе фотосенсибилизаторов (R= H или R= SO3Na). А - Фотосенс®; Б – Фталосенс®; В – 5-аминолевулиновая кислота.






Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.