WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Влияние фрагментированной экзогенной днк на рост экспериментальных опухолей мыши и активацию антигенпрезентирующих дендритных клеток

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Алямкина Екатерина Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТИРОВАННОЙ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК НА РОСТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШИ И АКТИВАЦИЮ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Богачев Сергей Станиславович

Официальные оппоненты: Таранин Александр Владимирович

доктор биологических наук, заведующий

лабораторией, Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН,

г. Новосибирск

Маркель Аркадий Львович

доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск.

Защита диссертации состоится «__»___________2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090

тел/факс: (383) 363-49-06 (1321); факс: (383) 333-12-78;

e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан «__»___________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Онкологические заболевания занимают третью строку в списке заболеваний человека, имеющих неблагоприятный прогноз. Стандартный подход к лечению рака представляет собой физическое удаление опухолевой массы и многократные курсы циторедуцирующей терапии. При этом часто остаточные опухолевые клетки рассредоточиваются по организму и формируют новые очаги опухолевой ткани. Одной из основных характеристик опухоли является ее способность подавлять активность иммунной системы, и тем самым создавать условия для беспрепятственного распространения по организму. В этой связи перспективным в борьбе с раком на разных этапах его развития является возможность активировать противоопухолевый иммунитет.

Важнейшим направлением в современной клинической практике лечения онкологических заболеваний является постредукционная иммунотерапия опухолей, связанная с активацией противоракового иммунитета. Существует два основных подхода к индукции противораковой активности иммунной системы: 1) in vivo адьювантная терапия с использованием пептидов, содержащих известные раковые антигены; 2) ex vivo активация профессиональных свойств антигенпрезентирующих дендритных клеток (ДК) с одновременным введением ракового антигена и последующей реинфузией пульсированных дендритных клеток в организм онкологического больного. Оба подхода связаны с активацией дендритных клеток и либо с индукцией иммунного ответа непосредственно в организме больного, либо с получением высокоспецифических дендритноклеточных вакцин.

В современной мировой практике описано несколько препаратов, стимулирующих дендритные клетки и влияющих на формирование противоракового адаптивного иммунитета. К хорошо известным препаратам относятся липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий (Cowdery et al., 1996; Hartmann, Krieg, 1999) и препараты ДНК на основе CpG-олигонуклеотидов (Hartmann, Krieg, 1999; Krieg et al., 1995; Pulendran, 2005). В последнее время установлено, что двуцепочечная ДНК (дцДНК) также приводит к созреванию дендритных клеток и индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет (Barber, 2011; Kawai, Akira, 2011). При этом охарактеризованы сигнальные пути, запускающие иммунный ответ клетки на появление в цитоплазме фрагментов дцДНК (Barber, 2011; Vilaysane, Muruve, 2009).

Настоящая работа посвящена исследованию противоракового действия препарата на основе дцДНК человека в сочетании с химиотерапевтическими цитостатическими препаратами на мышиные опухоли и его влияния на антигенпрезентирующие дендритные клетки.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение роли фрагментированной экзогенной двуцепочечной ДНК в индукции противоракового иммунитета в экспериментальных условиях. Основными задачами, которые необходимо было решить в рамках настоящего исследования, были следующие:

  1. Определить влияние препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в сочетании с кросслинкирующим цитостатическим препаратом циклофосфаном на рост экспериментальных опухолей мыши и на иммунную систему экспериментальных животных, в частности, на дендритные клетки.
  2. Исследовать влияние препарата фрагментированной ДНК человека на активацию антигенпрезентирующих свойств дендритных клеток на примере экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток человека.
  3. Подобрать условия использования препарата геномной ДНК человека в сочетании с клиническими цитостатическими препаратами доксорубицином и циклофосфаном, оптимальные для проведения успешной противораковой терапии экспериментальных опухолей.

Научная новизна. 1) Впервые установлено, что обработка мышей с привитыми опухолями цитостатиком циклофосфаном в сочетании с препаратом фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека размером 200-6000 п.о. приводит к достоверному торможению роста экспериментальных опухолей мыши. При этом совместное введение цитостатиков доксорубицина и циклофосфана в сочетании с препаратом ДНК подавляет рост сформированной опухоли достигшей размера более 1 см3, а в случаях недавно перевитых опухолевых клеток в количестве до 300 тыс. полностью прекращает рост опухолевого графта. Обнаружено, что развивающийся противораковый эффект сопровождается увеличением содержания во фракции мононуклеаров периферической крови экспериментальных животных цитотоксических клеток, обладающих специфической активностью против клеток опухоли-графта.



2) Добавление фрагментов двуцепочечной ДНК человека в культуру экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток приводит к активации их профессиональных свойств. При этом происходит конечное созревание дендритных клеток, индуцируется продукция ими цитокинов Th1 пути, увеличивается аллостимуляторная активность дендритных клеток, приводящая к пролиферации Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту. 1) Инъекции экзогенной двуцепочечной ДНК человека на фоне инъекций цитостатиков циклофосфана и доксорубицина приводят к достоверному усилению регрессирующего действия цитостатиков на рост экспериментальных опухолей мыши.

2) Вакцинация мышей зрелыми дендритными клетками, стимулированными к созреванию препаратом фрагментированной ДНК человека, приводит к достоверному торможению роста прививаемого опухолевого трансплантата.

3) Препарат фрагментированной геномной ДНК человека индуцирует усиление аллостимуляторной активности культуры дендритных клеток человека, что приводит к увеличению доли цитотоксических перфорин-содержащих Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований явились базой для разработки стратегии лечения рака молочной железы и ее применения в исследованиях второй фазы клинических испытаний препарата на основе двуцепочечной ДНК человека («Панаген»), основанных на совместном применении программной полихимиотерапии по схемам FAC (циклофосфан+доксорубицин+фторурацил) и AC (циклофосфан+доксорубицин).

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск), международной конференции Annual Main Meeting of Society for experimental Biology (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания), международной конференции 7th European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13-17 сентября 2011 года, Дублин, Ирландия).

Публикации. Всего - 24, по теме диссертации - 10, из них 5 статей в рецензируемых зарубежных журналах, 5 тезисов на российских и международных конференциях.

Вклад автора. Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. Николина В.П. и к.б.н. Поповой Н.А. (ИЦиГ СО РАН). Работы с дендритными клетками человека проводились при участии д.м.н. Леплиной О.Ю. и к.м.н. Сахно Л.В. (НИИКИ СО РАМН), с дендритными клетками мыши – Ефремова Я.Р. (ИЦиГ СО РАН) и Решетниковой Е.С. (ИМКБ СО РАН).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 31 рисунок и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение препарата ДНК: препарат ДНК человека получали из плацент здоровых рожениц безфенольным методом согласно промышленному регламенту производства препарата «Панаген» (регистрационное свидетельство ЛСР №004429/08 от 09.06.2008).

Экспериментальные животные: в работе использовали мышей линии CBA/Lac. Опухоль прививалась животным в заднюю правую лапу внутримышечно. Животные контрольной группы вместо инъекций препаратов получали инъекции физ. раствора.

Получение дендритных клеток мыши: дендритные клетки мыши получали из мононуклеарной фракции клеток костного мозга по стандартным протоколам (Lutz et al., 1999; Ахматова, 2007) с добавлением полилизата клеток опухоли, используя в качестве дозревающих стимулов препарат ДНК человека или ФНО.

Вакцинация мышей дендритными клетками: вакцинация животных проводилась трижды с интервалом в две недели по 500 тыс. клеток, подкожно в области спины. Опухоль прививалась животным за неделю до последней вакцинации.





Генерация дендритных клеток человека: дендритные клетки человека генерировали по стандартным интерлейкиновому или интерфероновому протоколам из гепаринизированной венозной крови (Della Bella et al., 2004; Thurner et al., 1999), индуцируя к созреванию либо препаратом ДНК, либо ЛПС.

Оценка функционального состояния дендритных клеток человека: аллостимуляторную активность дендритных клеток человека оценивали по реакции в СКЛ по включению 3H-тимидина, используя в качестве отвечающих клеток МНК здоровых доноров (Сахно и др., 2007; Сахно и др., 2008). Анализ продукции цитокинов дендритными клетками человека проводили с использованием стандартного планшета 17-plex согласно инструкциям, предложенным фирмой-производителем (Bio-Plex Pro™ Human Th17 Cytokine Assays, Bio-Rad, США). Анализ содержания CD8+/перфорин+ Т-клеток в периферической крови человека проводили с использованием меченых антител согласно протоколам, предложенным фирмой-производителем (BD Bioscience, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ противораковой активности препарата ДНК при его использовании в сочетании с цитостатиком ЦФ

В современной мировой клинической практике и в многолетних научных исследованиях наиболее изученными и эффективными индукторами противораковой активности иммунной системы организма являются ЛПС и иммуногенная CpG-ДНК. ЛПС обладает активирующим действием на макрофаги, стимулируя их к синтезу и секреции ФНО и ИФН- (Cowdery et al., 1996), CpG-содержащая ДНК обладает способностью активировать иммунокомпетентные Т-лимфоциты, натуральные киллеры, макрофаги и ДК. Это свойство CpG-ДНК активно исследуется с целью применения в терапии онкологических заболеваний (Олишевский и др., 2006; Ishii, Akira, 2006; Krieg, 2007; Medzhitov, 2007; Ракофф-Наум, Меджитов, 2008).

В последние годы все больше внимания уделяется изучению эффекта активации антигенпрезентирующих клеток, в том числе и ДК, дцДНК (Takaoka, Taniguchi, 2008; Ishii et al., 2001; Kis-Toth et al., 2011; Vilaysane, Muruve, 2009). Имеются многочисленные экспериментальные данные, позволяющие полагать, что фрагментированная дцДНК способна взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками и оказывать влияние на процессы их дифференцировки и созревания (Decker et al., 2005; Yasuda et al., 2005; Ishii, Akira, 2006; Martin, Elkon, 2006; Rnnefarth et al., 2006; Ishii et al., 2001). Описано также синергичное противоопухолевое действие охарактеризованного активатора ДК CpG-ДНК и цитостатика ЦФ (Krieg et al., 1995; Weigel et al., 2003).

В лаборатории молекулярной биологии клетки ФГБУН ИЦиГ СО РАН был обнаружен эффект противораковой активности препарата дцДНК человека, который также значительно усиливался при синергичном действии с цитостатиком циклофосфаном. Как показано в настоящем исследовании, описанный феномен связан с активацией ДК препаратом дцДНК с последующей индукцией противоракового иммунитета.

На начальных этапах настоящей работы был охарактеризован используемый препарат ДНК. Он представляет собой геномную ДНК человека, полученную из плацент здоровых рожениц безфенольным методом фрагментированную до размеров 200-6000 п.о. Анализ препарата различными методами показал, что он не содержит полисахаридов и гистоновых белков. Также было показано, что гидролиз препарата ДНК человека ДНКазой приводит к потере его противораковой активности, что подтверждает факт того, что активную фракцию субстанции препарата ДНК составляют линейные фрагменты дцДНК (данные не приведены).

Далее была проведена серия экспериментов по оптимизации условий совместного использования препарата ДНК и цитостатика ЦФ для воздейтсвия на мышиные опухоли. Было показано, что наиболее сильное действие, тормозящее развитие экспериментальных опухолей мыши, обнаруживалось при предварительных инъекциях цитостатика ЦФ и препарата ДНК до прививки опухоли (схема 1) (различные схемы инъекций препаратов и динамика роста опухолей у животных представлены на Рис. 1).

 Динамика роста опухоли Кребс-2 при различных схемах обработки мышей ЦФ-0 Рис. 1. Динамика роста опухоли Кребс-2 при различных схемах обработки мышей ЦФ и препаратом ДНК до или после прививки опухоли (отражена стандартная ошибка, n=10, p<0,001). Снизу приведены схемы соответствующих инъекций (ЦФ – циклофосфан; в/б – внутрибрюшинно; п/к – подкожно). Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора.

Наши дальнейшие исследования показали, что противораковая активность препарата ДНК человека заметно усиливалась при его введении в сочетании с цитостатиком ЦФ с последующей иммунизацией экспериментальных животных гомогенатом клеток опухоли (Рис. 2). Эффект торможения роста опухоли при обработке ЦФ, ДНК и иммунизации составил в среднем 84% по сравнению с контрольной группой животных, которые получали инъекции физ. раствора (p<0,001). При иммунизации животных без предварительной обработки препаратом ДНК средняя эффективность торможения роста опухоли составила 67% относительно контроля.

 Динамика роста опухоли Кребс-2 при обработке групп мышей ЦФ и-1

Рис. 2. Динамика роста опухоли Кребс-2 при обработке групп мышей ЦФ и препаратом ДНК с последующей иммунизацией гомогенатом опухоли графта (отражена стандартная ошибка, n=6). Снизу приведена схема инъекций: мыши группы «иммунизация» были иммунизированы только гомогенатом клеток опухоли; «ЦФ+иммунизация» – иммунизированы после инъекции ЦФ; «ЦФ+ДНКчеловека+иммунизация» – иммунизированы после инъекций ЦФ и препарата ДНК, согласно схеме (ЦФ – циклофосфан; в/б – внутрибрюшинно; п/к – подкожно; инакт. кл. – гомогенат клеток опухоли Кребс-2). Животные контрольной группы получали инъекции физ. раствора.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.