WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Экспериментальное доказательство возможности создания тканеспецифических ингибиторов ацетилхолинэстеразы

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Никиташина Александра Дмитриевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ВОЗМОЖНОСТИ СОЗДАНИЯ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

03.03.01 – физиология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена на базе кафедры прикладной экологии Института экологии и географии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (Казань), лаборатории биофизики синаптических процессов ФГБУН «Казанский Институт биохимии и биофизики» КазНЦ РАН (Казань) и лаборатории химико-биологических исследований ФГБУН «Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова» КазНЦ РАН (Казань).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Зобов Владимир Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ситдикова Гузель Фаритовна

доктор биологических наук, профессор

Нигматулина Разина Рамазановна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург.

Защита состоится «2» апреля 2013 г. в «14.00» часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.28 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» http://ksu.ru

Автореферат разослан 1 марта 2013 г

Ученый секретарь

диссертационного cовета

д.м.н., профессор Зефиров Т.Л.

Введение

Актуальность исследования.

Фермент ацетилхолинэстераза (АХЭ) - один из ключевых элементов, обеспечивающих нормальное функционирование холинергических синапсов за счет ограничения времени действия ацетилхолина, освобождающегося из нервного окончания. Ингибиторы АХЭ широко используются в медицинской практике для фармакологической коррекции синаптических дефектов, лежащих в основе болезни Альцгеймера, миастении Гравис и других форм патологической мышечной слабости (Birks, 2006; Brenner et al., 2008). Показана их эффективность и при лечении глаукомы (Sakamoto et al., 2010), атонии кишечника (Lee et al., 2010), травматических повреждений мозга, алкоголизма, маниакально-депрессивных психозов, шизофрении, аутизма, расстройств сна и др. (Cummings, 2000). Однако использование существующих антиАХЭ препаратов в медицинской практике осложняется одним недостатком, присущим всем без исключения ингибиторам – полным отсутствием избирательности в отношении фермента разных органов и тканей. Поэтому наряду с положительным (терапевтическим) действием, ингибиторы АХЭ всегда оказывают побочные эффекты (диарея, частое мочеиспускание, тошнота, рвота, абдоминальные боли, брадикардия, аритмия, повышенная бронхиальная секреция, повышенное слюноотделение, и т.д.), связанные преимущественно с гиперактивацией холинорецепторов вегетативной нервной системы (в основном, гладкой мускулатуры) (Прозоровский, Саватеев, 1976; Eddleston et al., 2005; Pope et al., 2005).

Вышеописанных недостатков были бы лишены ингибиторы АХЭ, способные оказывать целевой эффект в определенных органах и тканях. В частности, для терапии миастений различной этиологии перспективным представляется использование ингибиторов, более эффективных в синапсах скелетных (поперечнополосатых) мышц, по сравнению с гладкой мускулатурой. Однако вещества с подобными свойствами известны не были. Относительно недавно при исследовании нового класса ингибиторов АХЭ, синтезированных в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (под руководством проф. Резника В.С.) - алкиламмониевых производных 6-

Научным консультантом по всем аспектам, связанным с воздействием ингибиторов ацетилхолинэстеразы на синаптическую передачу возбуждения, работы является Петров К.А. (к.б.н., ст. науч. сотр. лаб. химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова)

метилурацила - впервые появились предпосылки говорить о том, что селективное ингибирование АХЭ в отдельных органах возможно. Так, было показано (Petrov et al., 2006; Petrov et al., 2009) что синапсы мышц, участвующих в дыхании, более устойчивы к действию одного из представителей данного класса (соединение №547) по сравнению с синапсами мышц конечностей. Описанные различия между дыхательной и локомоторной мышцами не проявлялись в присутствии традиционных ингибиторов холинэстераз – карбаматного (неостигмин) и фосфорорганического (армин) (Petrov et al., 2011). Таким образом, соединение №547 может быть первым кандидатом на роль тканеспецифического ингибитора АХЭ.

Анализ механизмов избирательности действия соединения №547 показал, что частично она может объясняться активностью фермента бутирилхолинэстеразы, которая компенсирует ингибирование АХЭ (Petrov et al., 2011). Однако полностью объяснить существующие различия «компенсаторной» ролью бутирилхолинэстеразы не удавалось. Таким образом, появились основания полагать о наличии иного механизма действия, обеспечивающего устойчивость дыхательной мускулатуры к действию соединения №547 по сравнению с локомоторными мышцами (Petrov et al., 2011). Дальнейшее исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе различий чувствительности органов к соединению №547, несомненно, позволит повысить эффективность поиска и создания тканеспецифичных ингибиторов АХЭ.



В связи с тем, что абсолютное большинство побочных эффектов ингибиторов АХЭ связано с гиперактивацией гладкой мускулатуры, ответ на вопрос об эффективности соединения №547 (и других подобных соединений) в отношении гладких мышц представляет большой практический интерес.

Цель и основные задачи исследования:

Цель данной работы - исследование механизмов действия алкиламмониевых производных 6-метилурацила и их специфичности по отношению к АХЭ скелетной и гладкой мускулатуры.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

  1. На основании анализа амплитудно-временных характеристик спонтанных постсинаптических ответов сравнить антихолинэстеразную эффективность соединения №547 в синапсах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) и диафрагмальной мышц мыши.
  2. Используя мышей, нокаутированных по разным видам холинэстераз, конкретизировать фермент (бутирилхолинэстераза, АХЭ, отдельные молекулярные формы АХЭ), ответственный за формирование устойчивости диафрагмальной мышцы к соединению №547.
  3. Исследовать влияние физической нагрузки, приводящей к изменению соотношения молекулярных форм АХЭ, на эффективность соединения №547 в синапсах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) мышцы крысы.
  4. Сравнить эффективность пиридостигмина и соединения №547 в препаратах локомоторной (длинный разгибатель пальцев) и гладкой мускулатуры (мочевой пузырь, прямая кишка) крысы в опытах ex vivo.
  5. На экспериментальной модели миастении Гравис проверить способность соединения №547 снижать выраженность признаков синаптического дефекта.
  6. Провести скрининг новых синтезируемых алкиламмониевых производных с целью выявления наиболее активных ингибиторов ацетилхолинэстеразы. Сравнить эффективность отобранных соединений в препаратах локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев) и гладкой мускулатуры (мочевой пузырь) крысы.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Ацетилхолинэстераза в синапсах диафрагмальной мышцы и в гладкой мускулатуре мочевого пузыря и кишечника крыс более устойчива к действию соединения №547 (ингибитор ацетилхолинэстеразы) по сравнению с ферментом синапсов локомоторной мышцы (длинный разгибатель пальцев). Степень устойчивости диафрагмальной мышцы к соединению №547 положительно коррелирует с наличием ацетилхолинэстеразы, заякоренной посредством PRiMA субъединицы.
  2. Соединение №547 может рассматриваться как потенциальное лекарственное средство для коррекции синаптического дефекта, лежащего в основе миастении Гравис.

Научная новизна

В работе впервые проанализировано участие различных молекулярных форм АХЭ в формировании устойчивости синапсов дыхательной мускулатуры к алкиламмониевым производным 6-метилурацила. Впервые исследовано влияние производных 6-метилурацила на работу гладкой мускулатуры крысы. В работе показано, что эти соединения проявляют избирательность действия в отношении скелетной мускулатуры, по сравнению с гладкой мускулатурой. Также было впервые показано, что представитель данного класса (соединение №547) способно устранять признаки мышечной слабости в экспериментальной модели миастении Гравис.

Научно-практическая ценность

Информация об особенностях строения АХЭ разных органов, как основы разной эффективности ингибирования производными 6-метилурацила, также как анализ зависимости «структура-активность» исследуемых соединений могут быть использованы для дальнейшего направленного синтеза органоспецифических ингибиторов АХЭ. Результаты данного исследования позволяют рассматривать алкиламмониевые производные 6-метилурацила как потенциальные лекарственные средства для лечения миастении Гравис и миастеноподобных состояний, лишенных целого ряда побочных эффектов, вызываемых гиперативацией холинорецепторов гладких мышц. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре прикладной экологии Института экологии и географии К(П)ФУ. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (№ 12-04-32056-мол-а, 11-04-12102-офи-м, 11-04-01188-мол-а-вед, 12-04-33296, «Ведущая научная школа» НШ-64631-2010.7.

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных подтверждается использованием достаточного объема экспериментальных исследований, постановкой и решением поставленных задач, статистической обработкой полученных результатов.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях и съездах: международном XIII Биологическом симпозиуме студентов и аспирантов «SymBioSE 2009», VI международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010, 2011 г.), XXIII международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2011), международной конференции молодых ученых «Биология-наука 21-го века! (Пущино, 2012), международном съезде «The 11th International Meeting on Cholinesterases» (Казань, 2012), Съезде фармакологов России (Казань, 2012), международной конференции «Molecular mechanisms of synaptic transmission regulation» (Киев, 2012), ежегодных научных отчетных конференциях в Казанском Федеральном Университете и Институте органической и физической химии им. А. Е. Арбузова (2010, 2011, 2012).





Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 113 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 125 источников, из них 16 - отечественных и 109 - иностранных авторов. Диссертация содержит 15 рисунков и 2 таблицы.

Объект и методы исследования

Эксперименты проводили на лабораторных беспородных крысах обоих полов весом 250-300гр., на мутантных мышах линии Del1, (-/-)PRiMA, (-/-)ColQ, (-/-) BuChE. Опыты на мутантных мышах проводились в лаборатории Университета Рене Декарта (Париж), животные были любезно предоставлены Dr. Krejci (Universite Paris Descartes, Paris)

Электрофизиологические эксперименты проводили на изолированных мышечных препаратах диафрагмальной мышцы (диафрагма, m. Diaphragma) и длинном разгибателе пальцев (m. EDL - Extensor Digitorum Longus). Тензометрические исследования проводились на изолированных препаратах гладкой мускулатуры мочевого пузыря и прямой кишки крысы. Изолированные препараты помещали в экспериментальную ванночку, через которую протекал аэрированный карбагеном (О2 95%, СО2 5%, в течение 45 мин) раствор Рингера-Кребса следующего состава (ммоль/л): NaCl – 120.0, KCl – 5.0, CaCl2 – 2.0, MgCl2 – 1.0, NaHCO3 – 11.0, NaH2PO4 – 1.0, глюкоза – 11.0, рН раствора поддерживали на уровне 7.2-7.4 при температуре 20±2Со. Соединение №547, а также другие представители производных 6-метилурацила были синтезированы в лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН. Ингибиторы АХЭ – пиридостигмин бромид и неостигмин (прозерин), а так же все реактивы для биохимических исследований приобретены в «Sigma-Aldrich».

Миниатюрные потенциалы (МПКП) и токи (МТКП) концевой пластинки регистрировали с помощью стандартной микроэлектродной техники. МТКП регистрировали с использованием двухэлектродной фиксации мембранного потенциала мышечного волокна (на уровне -60 мВ). Анализировали амплитуду и постоянную времени спада () сигналов. Для предотвращения спонтанных мышечных сокращений, вызванных ингибированием АХЭ, в омывающий мышцу раствор добавляли блокатор Na+-каналов тетродотоксин (0.1 моль/л).

Сокращения препаратов гладкой мускулатуры регистрировали и измеряли с помощью компьютерной программы Virtual Chart Recorder 1024768. Сокращения препаратов мочевого пузыря вызывали добавлением в омывающий препарат раствор ацетилхолина (100 моль/л). Сокращения препаратов прямой кишки крысы вызывали стимуляцией электрическим сигналом с амплитудой 50 В, длительностью стимула 0,5 мс, частотой 50 Гц в течение 15 сек. Анализировали силу сокращений препаратов.

Биохимическое исследование ингибиторной активности новых синтезированных соединений проводилось на АХЭ эритроцитов человека («Sigma-Aldrich»). Регистрацию ферментативной реакции осуществляли согласно методу Элмана (Ellman et al., 1961). Зависимость активности АХЭ от концентрации ингибитора оценивали с помощью уравнения Хилла (Hill), рассчитывая среднеэффективную концентрацию – IC50

Экспериментальная аутоиммунная модель миастении Гравис

Экспериментальную аутоиммунную модель миастении Гравис (ЭАМГ) создавали по методике, описанной в статье Baggi et al., 2003. Крыс (самки, возраст 6-8 недель) иммунизировали дважды (с интервалом в месяц) подкожным введением белка (последовательность 97-116 -субъединицы АХР), растворенного в CFA/IFA (complete/incomplete Freund’s adjuvant – стимулятор иммунного ответа). Развитие мышечной слабости диагностировали по наличию выраженного декремента амплитуды интегрального потенциала действия (ПД) мышц задних конечности крысы при высокочастотной стимуляции седалищного нерва (40Гц, 200 стимулов), а также по уменьшенной, по сравнению с контрольной, амплитудой МТКП в «быстрой» мышце m. EDL.

Пиридостигмин и соединение №547 разводили в физиологическом растворе и вводили интраперитонеально.

Электрофизиологические эксперименты, индукция и диагностика экспериментальной миастении Гравис выполнены совместно с К.А. Петровым (к.б.н., ст. науч. сотр. лаб. химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова).

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние соединения №547 на амплитуду и постоянную времени спада МПКП в диафрагме мутантных мышей

В данной серии экспериментов стояла задача выявить фермент, ответственный за формирование устойчивости диафрагмальной мышцы (диафрагма) к действию соединения №547, используя мышей, нокаутированных по БуХЭ, АХЭ и отдельным молекулярным формам АХЭ. Для этого предварительно было проверено, обладает ли диафрагма мышей «дикого типа» устойчивостью к действию соединения №547 по сравнению с локомоторной мышцей m. EDL.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.