WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Синапсис и рекомбинация у млекопитающих – носителей хромосомных перестроек клеточная биология, цитология, гистология-

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи


ТОРГАШЕВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

СИНАПСИС И РЕКОМБИНАЦИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ НОСИТЕЛЕЙ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК



Клеточная биология, цитология, гистология- 03.03.04








АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук





Новосибирск 2011

Работа выполнена в лаборатории рекомбинационного и сегрегационного анализа Учреждения российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бородин П.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Кузнецова Т.В.

НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН,

г. Санкт-Петербург

кандидат биологических наук

Федорова С.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет,

г. Санкт-Петербург


Защита диссертации состоится «___» ____________ 20___ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06,
факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова


Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у гомо- и гетерозиготных носителей хромосомных перестроек позволяет решить ряд актуальных проблем клеточной и эволюционной биологии.

На сегодняшний день, благодаря использованию мейотических мутантов, молекулярные механизмы синапсиса и рекомбинации достаточно хорошо изучены. Однако не до конца ясным остается то, каким образом осуществляется контроль и регуляция этих процессов, какие факторы определяют неравномерное и неслучайное распределение рекомбинационных событий вдоль хромосомы.

На молекулярном уровне положение сайтов рекомбинации определяется положением «горячих точек», активность которых зависит как от последовательности ДНК, так и от свойств хроматина (Smagulova et al., 2011). В этих точках с высокой вероятностью происходит образование двунитевых разрывов – событий, инициирующих рекомбинационный процесс.

Однако регуляция этого процесса осуществляется также на хромосомном уровне. На это указывают общие черты в распределении сайтов рекомбинации по хромосомам, обнаруженные на множестве изученных организмов. По всей вероятности, существенную роль в этой регуляции играют особенности морфологии хромосом и динамические преобразования их пространственной организации в профазе мейоза.

Использование хромосомных перестроек, меняющих морфологию хромосом и их расположение в ядре, таких как робертсоновские транслокации, парацентрические и перицентрические инверсии, в сочетании с современными методами иммунолокализации белков синаписиса и рекомбинации хромосом, позволит приблизиться к пониманию хромосомного уровня регуляции этих процессов.

Использование этого подхода представляется перспективным для анализа другой важной проблемы – роли хромосомных перестроек в эволюции кариотипов млекопитающих. Разные отряды млекопитающих, отдельные рода и виды внутри отрядов могут значительно отличаться друг от друга по количеству и типам зафиксированных хромосомных перестроек (O'Brien et al., 1999). Однако фиксация перестроек сопряжена с трудностями прохождения через мейоз у гетерозигот, поскольку они могут вызывать нарушения синапсиса и рекомбинации, приводящие к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии, стерильности, инактивации транскрипции и апоптозу (Turner et. al. 2005; Баранов, Кузнецова, 2007).

Степень этих нарушений зависит от характеристик конкретной перестройки. Изменения рекомбинационного паттерна, вызванные перестройками, могут менять приспособленность их носителей. Детальное изучение синапсиса и рекомбинации хромосом у представителей разных видов млекопитающих - носителей хромосомных перестроек позволит понять, чем определяется вероятность фиксации разных типов перестроек и какую роль они играют в видообразовании и в формировании репродуктивных изолирующих барьеров.



В данной работе эффекты робертсоновских транслокаций были изучены на животных из гибридной зоны между двумя хромосомными расами обыкновенной бурозубки. Популяции данного вида отличаются значительным полиморфизмом и политипизмом по робертсоновским транслокациям с различным сочетанием хромосомных плеч (Searle et al., 1991). Эффекты инверсий мы исследовали на самцах и самках мышей, гомо- и гетерозиготных по парацентрической инверсии в хромосоме 1, а также самцах муйской полевки, гетерозиготных по перицентрическим полноплечевым инверсиям в хромосомах 8 и 14. Анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у межвидовых гибридов проводился на самцах и самках гибридов между видами-близнецами серых полевок, которые различались несколькими робертсоновскими и тандемными транслокациями, перицентрическими инверсиями, образованием неоцентромер и добавочных блоков гетерохроматина (Mazurok et al., 2001). Присутствие в кариотипе гибридов нескольких перестроек разных типов позволяет оценить их кумулятивный вклад в возникновение мейотических нарушений и гибридной стерильности.

Цель и задачи работы. Целью данного исследования было изучение роли морфологии хромосом в регуляции распределения сайтов инициации синапсиса и точек рекомбинации с помощью иммунофлуоресцентного анализа мейотических клеток у гомо- и гетерозиготных носителей хромосомных перестроек (робертсоновских транслокаций, пара- и перицентрических инверсий) и у межвидовых гибридов, гетерозиготных по нескольким хромосомным перестройкам.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

  1. Оценить распределение точек рекомбинации в инвариантных и вариабельных хромосомах обыкновенной бурозубки, определить влияние гомо- и гетерозиготности по робертсоновским транслокациям на рекомбинационные паттерны отдельных плеч хромосом, вовлеченных в перестройки.
  2. На основе анализа мейоза у домовых мышей – носителей парацентрической инверсии в хромосоме 1, и муйских полевок – носителей перицентрических инверсий в хромосомах 8 и 14, определить влияние гетерозиготности по инверсиям на частоту и распределение сайтов рекомбинации по хромосомам, проанализировать зависимость синаптической подгонки инверсионных петель от локализации сайтов кроссинговера внутри инверсий.
  3. Установить характер и степень нарушений синапсиса хромосом у самцов и самок гибридов между видами-близнецами серых полевок, различающимися по серии хромосомных перестроек, оценить роль хромосомной дивергенции в возникновении и поддержании в природе гибридной стерильности у данных видов.

Научная новизна. С использованием метода иммунолокализации ключевых белков синаписа и рекомбинации впервые установлены особенности распределения сайтов кроссинговера у бурозубок, мышей и полевок – носителей хромосомных перестроек:

  • у обыкновенной бурозубки установлено смещение пиков рекомбинации по направлению к теломерам метацентрических хромосом, возникших за счет робертсоновских транслокаций, по сравнению с акроцентрическими вариантами хромосом;
  • выявлено существенное перераспределение рекомбинационного паттерна у мышей, гетерозиготных по парацентрической инверсии в хромосоме 1, и полное подавление рекомбинации в инвертированных участках хромосом 8 и 14 в природной популяции муйской полевки;
  • получены данные, свидетельствующие о зависимости степени синаптической подгонки от локализации сайтов кроссинговера в пределах инверсии.

Впервые проведен детальный анализ нарушений синапсиса и рекомбинации, приводящих к гибридной стерильности у гибридов двух видов полевок, выявлен половой диморфизм и значительный мозаицизм в степени проявления этих нарушений.

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы расширяют представления о клеточных механизмах, регулирующих распределение сайтов инициации синапсиса хромосом и точек рекомбинации. Полученные в работе данные проливают новый свет на механизмы поддержания полиморфизма по хромосомным перестройкам в популяциях млекопитающих, они используются в курсе лекций по эволюционной биологии в Новосибирском государственном университете.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Изменение морфологии хромосом при хромосомных перестройках приводит к изменению распределения сайтов инициации синапсиса и точек рекомбинации.
  2. Гетерозиготность по инверсиям у домовых мышей приводит к ослаблению кроссоверной интерференции и вызывает существенное перераспределение рекомбинационного паттерна как в инвертированных, так и в неперестроенных районах хромосом.
  3. Степень синаптической подгонки инверсионных петель у домовых мышей зависит от локализации сайтов кроссинговера внутри инверсии.
  4. Стерильность межвидовых гибридов F1 (Microtus arvalis arvalis и M. rossiaemeridionalis) обусловлена полной остановкой мейоза на стадии лептотены-зиготены у самцов и нарушениями синапсиса и рекомбинации хромосом на стадии пахитены у самок.

Личный вклад автора. Автор самостоятельно приготовил препараты распластанных синаптонемных комплексов (СК) ооцитов эмбрионов мышей, провел иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов всех исследованных животных, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), фотографирование и анализ изображений на флуоресцентном микроскопе и статистический анализ экспериментальных данных.





Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на IV школе молодых ученых ВОГиС по экологической генетике: «Экологическая генетика и теория эволюции» (Санкт–Петербург, 2007), II международной конференции: «Происхождение и эволюция биосферы» (Лутраки, Греция, 2007), международной конференции «Эволюция видов группы Sorex araneus: цитогенетические и молекулярные аспекты» (Йорк, Великобритания, 2008), симпозиуме памяти Г.А Левитского: «Хромосомы и эволюция» (Санкт–Петербург, 2008), V Всероссийском съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), международной конференции EMBO по мейозу (Исль-Сюр-Ла-Сорг, Франция, 2009), международной конференции EMBO по анеуплоидии и сегрегации хромосом (Эдинбург, Великобритания, 2010), международной конференции EMBO по мейозу (Капаччо-Паестум, Италия, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК и 8 тезисов докладов.

Структура и объём работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список использованной литературы (179 источников). Работа изложена на 133 страницах, содержит 22 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В работе были использованы 22 взрослых самца обыкновенной бурозубки, 11 самок и 7 самцов домовой мыши, 4 самца муйской полевки, 3 самца обыкновенной полевки, 3 самца восточно-европейской полевки и 2 самца и 12 самок гибридов между восточно-европейской и обыкновенной полевками.

Приготовление и иммуноокрашивание распластанных препаратов синаптонемных комплексов мейотических хромосом. Препараты СК распластанных хромосом готовили из сперматоцитов или из ооцитов эмбрионов по методике Петерса с соавторами (Peters et al., 1997). Иммуноокрашивание производили по методике Андерсон с соавторами (Anderson et al., 1999) с использованием следующих первичных антител: кроличьих поликлональных против белка бокового элемента СК SCP3 (1:500; Abcam), кроличьих поликлональных против белка центрального элемента СК SCP1 (1:200; Abcam), мышиных моноклональных против белка MLH1 (1:50; Abcam), мышиных моноклональных против белка H2AX (1:500; Abcam), кроличьих поликлональных против белка RAD51 (1:200; Calbiochem) и антител человека против центромерных белков ACA (1:100; Antiboodies Inc.). В качестве вторичных антител использовали антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с флуорохромом FITC (1:50; Jackson ImmunoResearch), антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch), антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Alexa450 (1:100; Invitrogen), антитела осла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с FITC (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories) и антитела осла против иммуноглобулинов человека, конъюгированные с FITC (1:100; Vector Laboratories). Антитела были использованы в различных комбинациях в зависимости от задач эксперимента.

Флуоресцентная гибридизация in situ. Гибридизационная проба для хромосомы 1 мыши Dist1 была получена Н.Б. Рубцовым. Для супрессии повторяющихся последовательностей пробу переосаждали с Соt-1 ДНК мыши. Гибридизацию с пробой Dist1 проводили на препаратах СК распластанных хромосом после иммуноокрашивания по стандартной методике.

Микроскопический анализ и идентификация бивалентов. Препараты анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой (CV M300, JAI), набором фильтров CHROMA и пакетом обработки изображений ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия). Хромосомы обыкновенной бурозубки идентифицировали с помощью DAPI-бэндинга. Хромосому 1 мыши и положение границ инверсии In(1)1Rk определяли с помощью пробы Dist1. Хромосому 14 муйской полевки идентифицировали с помощью гибридизации с хромосом-специфичной пробой (Н.А. Лемская, ИХМИФМ).

Поскольку при гибридизации на препаратах после иммуноокрашивания сигнал MLH1 и ACA удалялся, клетки после иммуноокрашивания фотографировали, записывали координаты, затем, после гибридизации, повторно регистрировали изображение. Такой же подход применяли при использовании антител против центромеры и MLH1, меченых одним и тем же флуорохромом (FITC). Препараты окрашивали последовательно: сначала антителами к MLH1, затем, после фотографирования, антицентромерными антителами ACA.

Измерение и статистический анализ. Измерение размеров бивалентов, регистрацию положения центромеры, гибридизованной пробы, числа и позиции обменов на хромосоме проводили с помощью программы MicroMeasure3.3 (Reeves, 2001). Для статистической обработки результатов использовали пакет программ STATISTICA. Все данные в тексте и таблицах представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (M ± SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Синапсис и рекомбинация хромосом у носителей робертсоновских транслокаций (на примере обыкновенной бурозубки Sorex araneus).



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.