WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВ Денис Валерьевич

Эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo

03.02.07 – Генетика

03.03.01 – Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл.

2012

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович ;
доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Коршунова Людмила Георгиевна ГНУ ВНИТИ птицеводства, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии;
доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич – пенсионер.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «18» декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ.

Автореферат разослан «___» ноября 2012 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 И.В. Гусев

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение биологических основ создания трансгенных форм является актуальной задачей современной науки. Трансгенез является неотъемлемой частью биотехнологий будущего, направленных на решение широкого спектра задач фундаментального и прикладного характера. Одним из перспективных направлений в данной области является создание трансгенных кур-биореакторов [Mozdziak et al., 2003; Kamihira et al., 2005; Kawabe et al., 2006, Kwon. et al., 2008; Сураева, 2008]. Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими обуславливают значительное преимущество использования птиц в качестве продуктивной платформы при производстве рекомбинантных белков со сложной структурой: птицы являются иммунноустойчивыми к потенциальным терапевтическим протеинам, таким как эритропоэтин человека, экспрессия которых может негативно влиять на состояние здоровья трансгенных млекопитающих, продуцирующих такие лекарства на коммерческом уровне. К тому же при использовании трансгенных птиц в качестве продуктивной платформы существенно снижается стоимость получаемых протеинов по сравнению с другими методами производства, такими как микробиологическая ферментация E.coli, дрожжи или клетки млекопитающих [Ivarie, 2003].

Однако, несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности их воспроизводства и развития, а именно трудности в точности определения овуляции, большое количество желтка в яйцеклетке, сильное уплотнение цитоплазмы около пронуклеусов, значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных – микроинъекции, что ограничивает использование трансгенных технологий в птицеводстве. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов, одним из которых является генетическая трансформация отдельных органов, в частности, яйцевода кур. Это позволяет значительно сократить материальные и временные затраты на получение трансгенных организмов по сравнению с использованием для адресной доставки ДНК других клеток-мишеней (клетки бластодермы, примордиальные зародышевые клетки, эмбриональные стволовые клетки), проведение генно-инженерных манипуляций с которыми возможно только на эмбриональном материале. В этой связи, изучение механизмов доставки экзогенной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo является актуальной задачей в рамках разработки и оптимизации отдельных этапов технологической цепочки создания трансгенной птицы.



Цель и задачи. Целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Изучить особенности гистогенеза белкового отдела яйцевода кур в различные возрастные периоды
  2. Оценить пролиферативную активность клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода разновозрастных кур.
  3. Определить возраст, оптимальный для введения рекомбинантной ДНК в клетки яйцевода кур in vivo
  4. Оценить компетентность клеток яйцевода кур к ретровирусным векторам in vitro.
  5. Ввести генные конструкции в клетки яйцевода кур in vivo.
  6. Выявить факторы, влияющие на эффективность локальной трансформации клеток яйцевода кур.

Научная новизна. Впервые изучена пролиферативная активность и особенности гистогенеза клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода кур в различные возрастные периоды в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки белкового отдела яйцевода кур посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток яйцевода in vivo. Рассмотрено влияние полового гормона на пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода.

Практическая значимость. Отработан метод введения генных конструкций в эпителиальный слой белкового отдела яйцевода кур in vivo, позволяющий трансформировать клетки эпителиального слоя до 57,3%. Установлен возраст кур, оптимальный для введения генных конструкций в клетки яйцевода in vivo. Предложена схема гормональной обработки кур в раннем возрасте, позволяющая повысить пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в секреторных клетках эпителия яйцевода подопытных кур по достижении ими половозрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Клетки эпителия белкового отдела яйцевода могут быть трансформированы с использованием ретровирусных векторов.
  • Оптимальным возрастом для эффективного введения генных конструкций в клетки яйцевода кур in vivo является период от 4 до 4,5 месяцев.
  • Гормональная обработка кур в раннем возрасте 0,1% синэстролом позволяет повысить эффективность генетической трансформации клеток яйцевода in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных – БиоТехЖ-2008», Дубровицы, 2008 г., «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра», С.-Петербург, 2010 г.; научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в т. ч. в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ - 2.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 101 странице, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 7 таблиц и 33 рисунка. Библиографический список включает 151 источник, в том числе 101 на иностранных языках.

  1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных и физиологическом дворе ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии согласно схеме, представленной на рисунке 1.

 Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция, ИГХ – иммуногистохимия -0

Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция, ИГХ – иммуногистохимия

Рис. 1. Схема исследований

Объектом исследований служили куры кросса «Птичное». Образцы яйцевода отбирались при убое птицы. Гистологические исследования белкового отдела яйцевода проводили в 6 возрастных категориях (от 1 месяца до 5 месяцев). В каждой группе было исследовано по 5 особей.

Фиксацию ткани яйцевода проводили в 10% формалине. Дегидратацию исследуемых образцов ткани и их заливку в парафин осуществляли по общепринятой методике [Ромейс Б., 1953]. Гистологические срезы готовили на ротационном микротоме. Для окраски использовали растворы гематоксилина и эозина. Анализ полученных гистопрепаратов осуществляли на микроскопе «Opton» (Германия), объективы х40, х10, с использованием программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»). При анализе учитывалась только слизистая оболочка белкового отдела яйцевода. От каждой особи было проанализировано не менее 20 гистосрезов эпителия. Содержание ДНК в эпителиальных клетках яйцевода определяли при окраске гистопрепаратов по Фельгину [Микроскопическая техника: Руководство, 1996].

Для трансформации клеток эпителия яйцевода использовали ретровирусные генные конструкции pLN-GFP, pLNins и pX-RSVhGH содержащие, соответственно, репортерные гены GFP (зеленый флюоресцирующий белок) и кДНК инсулина человека и гормон роста человека. Для упаковки рекомбинантных ретровирусов была использована линия-упаковщиц GP+envAm12.

Трансформацию клеток кур in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус [Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа генетически трансформированных клеток к общему числу клеток.

Введение генных конструкций (суспензия клеток-упаковщиц и вирусный препарат) в яйцевод кур in vivo осуществляли в возрасте 2 месяцев и 4-4,5 месяцев путем инъекции препарата в просвет белкового отдела яйцевода. Хирургическое вмешательство проводили с соблюдением правил асептики и антисептики, всей птице применяли одинаковую общую анестезию и послеоперационную терапию. В качестве источника генных конструкций использовали вирусный препарат и клетки-упаковщицы в концентрации 1 млн., 2 млн. и 3 млн. клеток на яйцевод.

Гормональную обработку подопытных кур проводили в возрасте 2 месяцев с использованием 0,1% раствора синэстрола в объеме 0,1 мл на голову.

Выделение ДНК из ткани яйцевода кур осуществляли солевым методом [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК в яйцеводе кур определяли методом ПЦР. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках эпителия яйцевода кур изучали методом иммуногистохимии с использованием первых антител, специфичных к выявляемому белку (GFP, инсулин, соматотропин).

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием стандартной компьютерной программы Microsoft Excel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Особенности гистогенеза яйцевода кур в различные возрастные периоды

Изучение морфологии белковой части яйцевода кур в различные возрастные периоды показало следующее.

В возрасте 1 месяца внутренний слой слизистой оболочки яйцевода был выстлан слоем цилиндрического эпителия (рис.2). Высота эпителия в этом возрасте достигала 9,50±0,16 мкм. Клетки характеризовались высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Площадь ядер составляла 7,56±0,3 мкм2, цитоплазмы - 7,12±0,4 мкм2.

1 - просвет яйцевода 2 - эпителий 3 - собственная пластинка слизистой оболочки Окраска гематоксилин-эозин Увеличение х400




Рис 2 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 1 месяца

В 2-месячном возрасте эпителий слизистой оболочки белковой части яйцевода кур претерпевал существенные изменения. Высота эпителиального слоя увеличивалась до 12,64±0,15мкм. Клетки располагались компактно и характеризовались вытянутой формой за счет сжатия боковых стенок клетки в результате увеличения площади цитоплазмы до 8,91±0,44 мкм2. Ядра в клетках занимали центральное положение. Средняя их площадь составила 8,34±0,34 мкм2.

Тенденция к увеличению размеров клеток эпителиального слоя слизистой оболочки яйцевода кур сохранялась и в возрасте 3 месяцев. Увеличение размеров цитоплазмы клеток сопровождалось смещением ядра к базальному краю (рис. 3). По сравнению с предыдущим периодом площадь цитоплазмы увеличилась почти в 2 раза, площадь ядра в 1,5 раза и составила, соответственно, 13,09±0,11 и 12,14±0,17 мкм2. Высота эпителиального слоя достигала 14,18±0,17 мкм.

1 - просвет яйцевода 2 - эпителий 3 - собственная пластинка слизистой оболочки Окраска гематоксилин-эозин Увеличение х400

Рис 3 Гистоструктура слизистой оболочки белковой части яйцевода кур в возрасте 3 месяцев

В возрасте 4 месяцев на гистопрепаратах яйцевода кур отмечалось увеличение размеров эпителиального слоя белковой части за счет формирования складок (рис. 4). Расширение эпителиального слоя было обусловлено увеличением как числа клеток, так и их размеров: площадь цитоплазмы достигала 20,29±0,19 мкм2, ядра – 15,91±0,22 мкм2 при высоте эпителиального слоя 16,95±0,16 мкм.

1 - просвет яйцевода 2 - эпителий 3 - собственная пластинка слизистой оболочки Окраска гематоксилин-эозин Увеличение х400


Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.