WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВА Елена Викторовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕТУХОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

03.02.07 – Генетика

03.03.01 – Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл.

2012

Работа выполненав Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;
доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Коршунова Людмила Георгиевна ГНУ ВНИТИ птицеводства, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии;
доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич– пенсионер.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится «11»декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖ.

Автореферат разослан «___» ноября2012 года.

Ученый секретарь Cовета Д 006.013.03 И.В. Гусев

  1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Использование клеток гонад рассматривается как один из перспективных методов получения трансгенных животных, в том числе птицы [Коржикова С.В., 2002; Савченкова И.П. и др., 2006; Новгородова И.П. и др., 2008;Эрнст Л.К. и др., 2008;Волкова Н.А. и др., 2011].Несмотря на наличие целого ряда методов доставки рекомбинатной ДНК в эмбриональные клетки птиц [SangH., 2004.PetitteJ. etal., 2004; Kamihira М. etal., 2005; KawabeY. etal., 2006;Эрнст Л.К. и др., 2009], интерес к использованию клеток семенников сохраняется вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Среди всех типов клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей сосредоточен на использовании стволовых клеток сперматогоний. Популяция данного типа клеток постоянно обновляется, что открывает широкие возможности реализации их потенциала при получении трансгенной птицы: репликация сперматогонийинициирует комплексный процесс их дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев.

Вместе с тем, не смотря на ряд преимуществ использования половых клеток в качестве объекта для адресной доставки ДНК, на сегодняшний день нет однозначных данных о молекулярных механизмах транспорта генов в данные клетки-мишени и эффективных способах их трансформации. Решение данной проблемы позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Цель и задачи.Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных петухов.
  2. Дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от возраста петухов.
  3. Выявить оптимальныйвозраст петухов для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогеного эпителия.
  4. Определить эффективность генетической трансформации клеток семенников петуховinvitro с использованием ретровирусных векторов.
  5. Изучить результативность генетической трансформациисперматогенных клеток петуховinvivo.

Научная новизна. Впервые подробно изучены гистологические особенности семенников петухов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителияпосредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда семенниковinvivo.



Практическая значимость. Определен возраст петухов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных манипуляций. Отработан метод введения генных конструкций в семенники петуховinvivo. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в данный орган-мишень. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке: наличие рекомбинантной ДНК установлено в спермиях по достижении половой зрелости.

Основные положения, выносимые на защиту

  • Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах семенников петухов изменяется в зависимости от возраста.
  • В сперматогенном эпителии семенных канальцев петухов постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза.
  • Клетки сперматогенного эпителия петухов могут быть трансформированы invivo с использованием ретровирусных векторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: научной конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра», С.-Петербург, 2010 г., «Высокие технологии, исследования, промышленность», С.-Петербург, 2010 г., научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК – 3.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 9 таблиц, 28 рисунков. Список литературы содержит 150 источников, в том числе 112 на иностранных языках.

  1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. в Центре физиологическом дворе ГНУ ВИЖРоссельхозакадемии согласно схеме, представленной на рисунке 1.

 Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция, ИГХ –иммуногистохимия -0

Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция, ИГХ –иммуногистохимия

Рис.1.Схема исследований

Объектом исследований служили петухи кросса «Птичное». Образцы семенников отбирался при убое птицы.Гистологические исследования семенников петухов (n=95) проводились в 19 возрастных категориях (от 1 недели до 12 месяцев). В каждой группе было исследовано по 5 голов.

Для фиксации ткани семенников использовался раствор Буэна. Дегидратацию исследуемых образцов ткани и их заливку в парафин проводили по общепринятой методике[Ромейс Б., 1953]. Срезы семенников готовили на ротационном микротоме и окрашивали растворами гематоксилина и эозина. Анализ полученных гистопрепаратов осуществляли на микроскопе «Opton» (Германия), объективы х40, х16, с использованием программы ImageScope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).При анализе учитывались только семенные канальцы, имеющие округлую форму. От каждого опытного петуха было проанализировано не менее 30 семенных канальцев.Клетки сперматогенного эпителия идентифицировали по их морфологии.Содержание ДНК в сперматогенныхклетках определяли при окраске гистопрепаратовпо Фельгину[Микроскопическая техника:Руководство, 1996].

Для трансформации клеток сперматогенного эпителия петухов использовали ретровирусныегенные конструкцииpLgfpSN и pBMN-lacZ, содержащие, соответственно, репортерные гены GFP (зеленый флюоресцирующий белок) и lacZ.Трансформацию клеток сперматогенного эпителия invitroосуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавлениявирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус[Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа генетически трансформированных клеток к общему числу клеток.

Введение генных конструкций (суспензия клеток-упаковщиц и вирусный препарат)в семенники петуховinvivoосуществляли в возрасте 2-2,5 месяцев. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщицихресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8мкг/мл). Вирусный препарат также вводили с добавлением полибрена (8 мкг/мл).

Выделение ДНК из эмбрионов кур осуществляли солевымметодом[Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК в эмбрионах кур определяли методом ПЦР.Экспрессию рекомбинантных белков в клетках сперматогенного эпителия семенников петуховизучали методом иммуногистохимии с использованием первых антител, специфичных к GFP.





Статистическую обработку данных осуществляли с использованием стандартной компьютерной программы MicrosoftExcel.

  1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Особенности сперматогенеза петухов в различные возрастные периоды

Гистоструктура семенных канальцев петуха характеризовалась наличием соединительно-тканной оболочки, внутренний слой которой был образован сперматогенным эпителием. Данный слой был представлен двумя популяциями клеток: поддерживающими клетками (клетки Сертоли) и сперматогенными клетками на разных стадиях дифференцировки (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, спермии).

С возрастом число семенных канальцев на единицу площади ткани семенника изменялось (табл. 1).

Табл. 1.Морфологическая характеристика гистоструктуры семенника петуха

Возраст

Среднее число семенных канальцев на 1 мм2

Среднее число сперматогенных клеток в семенном канальце, n

Диаметр семенных канальцев

Площадь семенных канальцев

1 нед

201±22

25±0,3

50,5±1,2

1871±82

2 нед

188±9

30±0,3

61,4±1,1

2715±93

3 нед

170±7

30±0,2

60,8±0,9

2638±74

4 нед

145±9

31±0,3

62,1±0,5

2771±40

5 нед

136±8

30±0,3

62,1±0,6

2795±59

6 нед

127±6

40±0,4

67,0±0,8

3207±71

7 нед

129±11

38±0,4

66,7±0,6

3203±55

8 нед

131±9

44±0,4

65,0±0,8

3036±76

9 нед

122±10

50±0,8

68,0±0,9

3331±97

10 нед

116±9

58±0,5

69,1±1,0

3368±90

11 нед

117±8

54±0,5

73,0±1,5

3862±153

12 нед

108±12

62±0,4

86,2±0,9

5348±116

3,5 мес

88±3

70±0,6

97,2±2,3

6963±306

4 мес

74±7

226±1,7

111,7±1,1

8962±172

4,5 мес

62±6

291±1,8

169,0±10,8

17787±282

5 мес

17±2

711±5,6

191,9±2,0

27092±564

5,5 мес

15±2

913±6,0

195,0±2,6

27877±525

6 мес

18±2

1154±7,6

186,8±2,0

23760±491



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.