WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели в реализации проапоптотического эффекта фактора некроза опухоли альфа на лимфоциты крови

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

БИКТАСОВА

Асель Кинжибулатовна

РОЛЬ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ

ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОГО

ЭФФЕКТА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ

14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Томск)

Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Рязанцева Наталья Владимировна
доктор медицинских наук Жукова Оксана Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Сафронов Игорь Дмитриевич
доктор медицинских наук Потапов Алексей Валерьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится «16» марта 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, Новосибирск, 630117.

Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан «10 » февраля 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

д. б. н. Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Патогенез многочисленных заболеваний человека (иммунопатологические состояния, злокачественные новообразования, хронические инфекционные процессы и др.) тесно связан с нарушением клеточной гибели. Одной из ведущих причин дизрегуляции танатогенной программы клеток является изменение продукции клетками и/или модуляция биологических эффектов фактора некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor, TNF) (Bazzoni F., Beutler B., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al., 2001; Joussen A.M. et al., 2009). В физиологических условиях TNF участвует в эмбриогенезе, развитии разнообразных тканей, при патологии – играет ведущую роль в формировании воспалительных реакций и специфического иммунного ответа (Ройт А., 2000; MacEwan D.J., 2002; Хаитов Р.М., 2006; Кулинский В.И., 2007). Действие TNF на клетки-мишени осуществляется за счет связывания со своими высокоаффинными рецепторами, расположенными на плазматической мембране, что ведет к интрацеллюлярным реакциям, находящим свое отражение в изменении их функционального статуса, в том числе и посредством инициации клеточной гибели (MacEwan D.J., 2002; Gupta S. et al., 2005).

К настоящему времени выявлена способность TNF инициировать как апоптотическую гибель клеток, опосредованную повышенной секрецией данного цитокина при воспалительных заболеваниях аутоиммунного и инфекционного генеза, так и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNF при септических состояниях. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNF, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина на реализацию танатогенной программы. (Faraco P.R. et al., 1999; Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Lin Y. et al., 2004; Temkin V. et al., 2006; He S. et al., 2009). Однако экспериментальные факты, свидетельствующие в пользу указанного предположения, немногочисленны, что обуславливает целесообразность изучения действия различных концентраций рекомбинантного TNF на инициацию того или иного вида TNF-опосредованной клеточной гибели.

Накопленные к настоящему времени сведения о TNF-зависимых механизмах запуска летальной программы достаточно детально, по сравнению с другими видами цитокиноопосредованного апоптоза, описывают события, происходящие в клетке при реализации TNF-индуцированной апоптотической гибели. Однако вследствие использования исследователями разных клеточных моделей и экспериментальных условий возникают серьезные трудности в интеграции многочисленных разрозненных фактических результатов, касающихся указанной проблемы (Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Liu B. et al., 2008). Особенно остро данный вопрос стоит в отношении механизмов мобилизации заключенных в межмембранном митохондриальном пространстве апоптогенных факторов, находящейся под контролем белков семейства Bcl-2 (Jiang P. et al., 2006; Chen X. et al., 2007).



Образование и/или деградация анти- и проапоптотических членов семейства протеинов Bcl-2 регулируется транскрипционными факторами, в том числе NF-kB и Р53. Вовлеченность NF-kB и Р53, а также представителей семейства белков Bcl-2 в реализацию TNF-индуцированной апоптотической гибели не вызывает сомнений. Однако отсутствие единой точки зрения о характере заинтересованности данных регуляторных молекул в TNF-опосредованный апоптоз делает целесообразным проведение комплексного исследования указанных протеинов при действии на клетки рекомбинантного цитокина и при патологии, сопровождающейся повышенной продукцией лимфоцитами TNF. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции и рецепции TNF, а также модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.

Цель исследования: установить роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели (белки семейства Bcl-2 и факторы транскрипции) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии фактора некроза опухоли альфа.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

  1. Установить дозозависимость влияния фактора некроза опухоли альфа на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови in vitro.
  2. Оценить причастность митохондриального пути (количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода) к регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного фактором некроза опухоли альфа.
  3. Определить содержание белков-регуляторов клеточной гибели (транскрипционные факторы NF-kB и Р53, ингибитор циклинзависимых киназ P21WAF1/Cip1, протеины семейства Bcl-2) в лимфоцитах крови, полученных у здоровых доноров, при действии рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа и у пациентов с острым клещевым энцефалитом, характеризующимся измененной продукцией фактора некроза опухоли альфа.
  4. Выявить общие закономерности и особенности влияния фактора некроза опухоли альфа на апоптоз лимфоцитов крови в условиях in vitro и при остром клещевом энцефалите.

Научная новизна. Впервые в условиях in vitro установлено, что рекомбинантный TNF человека дозозависимо влияет на реализацию апоптотической и некротической гибели лимфоцитов крови. Получены новые данные о регулирующей роли транскрипционных факторов NF-kB и Р53, а также о характере изменения баланса белков семейства Bcl-2 при реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNF. Установлено, что при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне повышенного образования TNF апоптоз лимфоцитов крови реализуется при участии митохондрий, активных форм кислорода и сопряжен с активацией транскрипционных факторов, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических Bcl-2-белков. Установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантного TNF in vitro в дозе 0,050 нг/мл, так и при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией данного цитокина, обусловлена запуском однотипных молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства Bcl-2 в TNF-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантной формы цитокина. Установлена роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при инфекционной патологии, сопровождающейся повышенной продукцией TNF. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию механизмов побочных эффектов анти-TNF-направленной терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменением продукции данного цитокина.

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Основы цитофизиологии; старение, гибель клетки, взаимодействие клетки с окружающей средой», «Инфекционный процесс: острые инфекции») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека оказывает прямой регулирующий эффект на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови.
  2. В условиях инфекционного процесса, сопровождающегося повышенной продукцией фактора некроза опухоли альфа (на примере клещевого энцефалита), и при культивировании клеток с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа регуляция апоптоза лимфоцитов крови осуществляется посредством молекулярных механизмов, связанных с активацией митохондриального пути, участием активных форм кислорода и транскрипционных факторов (NF-kB и P53), а также изменением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

Апробация диссертации. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), ХIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Х Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009).





Исследования выполнены в рамках проектов РФФИ – «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150_офи), «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-р_офи), а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проект «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови», государственный контракт № 02.512.12.0013 от 01.08.2008 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), поддержаны грантом Совета при Президенте РФ (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них – 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка цитированной литературы, включающего 258 источников, из них - 42 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 13 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были выделены два блока исследования: экспериментальный и клинический.

На первом этапе в условиях культивирования лимфоцитов здоровых доноров с рекомбинантным TNF (rTNF) в диапазоне концентраций от 0,015 до 0,150 нг/мл была проведена оценка дозозависимого влияния rTNF на вовлеченность указанных клеток в апоптоз и некроз, идентифицирована заинтересованность в реализации TNF-опосредованной апоптотической гибели активных форм кислорода, пермеабилизации митохондрий, транскрипционных факторов, белков семейства Bcl-2. На втором этапе была проведена проверка гипотезы об участии данных факторов в дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при клещевом энцефалите, сопровождавшегося изменением продукции цитокина.

В основу работы положены результаты комплексного обследования 65-ти человек (30 мужчин и 35 женщин, средний возраст 31±3 года). Из них 20 здоровых доноров и 45 пациентов с клещевым энцефалитом (КЭ), включая 25 лиц с острым клещевым энцефалитом (ОКЭ) и 20 человек с хронической антигенемией вируса КЭ (более 6 мес. после острого периода КЭ). Критериями исключения из исследования явились: возраст менее 18 или более 50 лет, наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней другой этиологии, период проведения противовирусной, иммуномодулирующей, а также иной фармакотерапии.

Обследованные пациенты находились либо на диспансерном учете, либо на стационарном лечении в неврологическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач – Н.Н. Бартфельд), а также в инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3» г. Томска (главный врач – М.А. Лукашов). Клинические группы были сформированы при непосредственном участии профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Н.Г. Жуковой. У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования манипуляций.

Материалом исследования являлась кровь, взятая утром натощак путем пунктирования локтевой вены и стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель – канд. мед. наук О.Е. Чечина).

Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлены в таблице 1.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.